在讨论流式细胞术中荧光补偿该如何调节的问题前，我们先了解下流式实验为何需要调补偿？

荧光分子在被激发后都会发射特定波长范围的光，但是这些荧光的发射光之间会发生光谱重叠。

荧光补偿的调节是纠正荧光素发射光谱重叠的过程，即从一个被检测的荧光信号中减掉溢漏过来的其他光。

荧光发射光光谱重叠示例：

以FITC和PE为例来看光谱重叠。FITC单染管的荧光会部分漏到PE通道中，而这部分需要从PE通道中减掉溢漏过来的FITC荧光。

那么荧光补偿该如何调节呢？

? 调节电压

? 检测荧光通道的自发荧光

? 每个荧光通道做单染管对照检测

何为单染管对照？

? 细胞

? 补偿微球

细胞通常是流式抗体单染管对照的样本，但是当细胞数量有限，无多余细胞用于抗体单染或感兴趣的表面抗原表达较低，阳性分群不明显不足以用来调节补偿时，建议选择补偿微球。

补偿调节时要注意：

? 使用未染色的细胞做PMT的电压设置

? 不要使用未染色的补偿微球设置电压

eBioscience提供两种补偿微球：OneComp eBeads与UltraComp eBeads。

微球大小和淋巴细胞相当，可连接各种荧光标记的抗体来调节补偿。每滴微球中都含有两群：一群是可以结合抗体的阳性群，一群是不会与抗体反应的阴性群。

优点：

? 使用方便，一滴即可

? 使用实验抗体与微球有效结合调节补偿，无需再用CD4分群来调节

? 细胞替代物，适应各种孵育时间，结果稳定

? 能与各种种属和亚型的抗体反应

竞争品牌的微球是分种属的，使用不同抗体要购买多个产品以使用

注：兔来源的抗体与微球结合力较弱，但某些还是可以使用

? 适用于各种激发光---适用于488 nm 蓝光，532 nm 绿光，561 nm 黄光，633-635 nm 红光，UltraComp eBeads尤其适用紫外 (355 nm) 或者 紫色 (405 nm) 激光器

? 微球本身信号经过优化适合补偿调节

? 价格相当，有小包装

操作步骤：

1. 准备好流式管，每种荧光抗体一个；

2. 将微球翻转或者涡旋混匀；

3. 在每管中加入一滴微球；

4. 在管中分别加入相应的 1 test 抗体（不同抗体 1 test 的用量不同，具体参见说明书）；

5. 敲击或者涡旋混匀；

6. 2-8℃暗处孵育 15-30 分钟；

7. 每管加 2ml 流式染色缓冲液，400-600 x g 离心 3-5 分钟；

8. 弃上清，每管加入 0.2-0.4 mL 流式染色缓冲液；

9. 混匀后上机