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免疫组化的标准步骤
更新时间:2017-04-17 点击次数:5844次

免疫组化步骤(ABC法)

 

1。4%多聚甲醛常规灌注固定,取材并置20%蔗糖溶液(4℃)中过夜。蜡块制作。切片,贴片。0.01MKPBS清洗5min×3后; 

2。加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液(甲醇80ml+0.01MKPBS 100ml+30%过氧化氢)30min,以消除内源性过氧化物酶的影响,0.01MPBS清洗5min×3; 

3。加入配好的0.3% Triton X100(30% Triton X100+0.01MKPBS 100ml)30min,以增加细胞的通透性,0.01MKPBS清洗5min×3; 

4。加入用血清稀释液(牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS 100ml+叠氮纳0.08g)稀释的一抗,4℃存放24-48h;吸去抗体,0.01MKPBS洗5min×3; 

5。加入0.01MKPBS稀释的的二抗,室温孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3; 

6。加入ABC复合物之类的抗体,室温孵育2h,0.01MKPBS洗5min×3;蒸馏水迅速冲三次; 

7。加入显色液,进行免疫组织化学显色,时间一般不超过30min,可不时在显微镜下进行观察,待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液,用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应; 

8。梯度酒精脱水之后,封片,拍照。 

 

免疫组化SP法步骤:

SP(streptavidin-perosidase)法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法.

按标记物质的种类,如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等,可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法);按结合方式可分为抗原—抗体结合,如过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法和亲和连接,如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法等,其中SP法是zui常使用的方法。 

一般的sp法步骤啊,具体如下:

1.烤片,68℃,20分钟,

2. 常规二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水;二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min 

3.阻断 灭活内源性过氧化物酶:3%H2O2 37℃孵育10min,PBS冲洗3X5min;

4. 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液(PH 6.0)中用煮沸(95℃,15-20min),自然冷却20min 以上,再用冷水冲洗缸子,加快冷却至室温,PBS冲洗3X5min。

5. 正常羊血清工作液封闭,37℃10 min,倾去勿洗.

6. 滴加一抗4℃ 冰箱孵育过夜,PBS冲洗3X5min(用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照);

滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;

7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液,37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;

8. DAB/ H2O2反应染色,自来水充分冲洗后,

苏木素复染,常规脱水,透明,干燥,封片。

 

 

免疫组化(Elivision二步法):

(1)石蜡切片置于67℃烘箱中,烘片2小时,脱蜡至水,用pH7.4的PBS冲洗三次,每次3分钟(3×3’)。

(2)取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液,加入微波盒中,微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,中档微波处理10分钟,取出微波盒流水自然泠却,从缓冲液中取出玻片,先用蒸馏水冲洗两次,之后用PBS冲洗2×3’。(注:不是所有的抗体都需要微波修复的,视具体情况而定)

(3)每张切片加1滴3% H2O2,室温下孵育10分钟,以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3’。

(4)除去PBS液,每张切片加1滴相应的*抗体(相应稀释倍数),室温下孵育2小时。

(5)PBS冲洗3×5’。除去PBS液,每张切片加1滴聚合物增强剂(试剂A),室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。

(6)除去PBS液,每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物(试剂B),室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’

(7)除去PBS液,每张切片加1滴新鲜配制的DAB液,显微镜下观察5分钟。

(8)苏木素复染,0.1%HCl分化,自来水冲洗,蓝化,切片经梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固,晾干后观察。

注:即用型第二代免疫组化Elivision plus广谱试剂盒,购自福州脉新生物技术开发有限公司。包括:生物素化抗兔二抗、亲和素(Reagent A)、生物素-辣根过氧化物酶(Reagent B)、二氨基联苯胺(DAB)

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