流式细胞技术实验方法

PI 染色操作步骤

1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。

3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。

4、离心，弃上清液。

5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。

6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。

7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。

8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。

9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。

GFP PI染色操作步骤

1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。

3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。 以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9）

细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤

1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。

3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。

4、离心弃上清液。

5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。

6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。

细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤

1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤

3、 用PBA稀释的*抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。离心，弃上清。

4、 PBS 1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。

5、 PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min，避光。

6、 PBS 1ml离心洗涤2次。

7、将细胞重新悬浮于500ulPBS中，混匀，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待测。

胞内直接免疫荧光染色操作步骤

1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500 rpm , 5 min，弃上清液。

2、用1×PBS 1 ml洗涤1次，离心。

3、4% PFA 1ml，4 ℃固定30min。

4、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。

5、0.1% Triton-100 1ml, 室温10min。

6、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。

7、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul，用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30 min-1h。

8、离心弃上清液。

9、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。

10、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。

胞内间接免疫荧光染色操作步骤

1-6、同胞内直接免疫荧光染色操作步骤

7、加入用PBA稀释的*抗体200 ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4 ℃或置冰上孵育1.5-2 h。离心，弃上清。

8、冷PBS 1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。

9、加入PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200 ul。吹打混匀，4 ℃或置冰上孵育30 min，避光。

10、冷PBA 1ml离心洗涤2次。

11、将细胞重新悬浮于500 ul PBS中，混匀，置流式管中，避光，4 ℃冰箱保存，待测。
备注：

1、 RNase A： 贮液浓度：1mg/ml ；

工作液配制：加1 mg/ml贮液 10ul于500ul 1×PBS中，使终浓度为 20ug/ml。

2、PI： 贮液浓度：2.5mg/ml；

工作液配制： 加2、5 mg/ml贮液 10ul于500ul 1×PBS中，使终浓度为 50ug/ml。

3、PBA ： 即PBS加1-2% 牛血清白蛋白，加0.1%叠氮钠。

4、检测样品细胞浓度1x10 /ml。