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免疫荧光方法中的重要环节说明
更新时间:2018-11-27 点击次数:1132次
  
  
  免疫荧光(Immunofluorescence)通过特异性荧光抗体结合细胞内的生物靶标抗原,从而实现对靶标分子在细胞内的分布及定位分析。该方法可以对组织块儿、培养细胞或单个细胞进行标记,用于分析蛋白、糖原、及生物/非生物小分子,与此同时,免疫荧光也可以DAPI、Hochest33342等其他非抗体荧光标记染料联合使用。
  
  免疫荧光方法中的重要环节:
  
  1.冰冻切片制备:建议用新鲜组织,否则组织细胞内部结构破坏,易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等,防止裂片和脱片严重。
  
  2.组织切片固定:切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min,尤其要较长时间保存的白片,一定要及时固定和适当保存。
  
  3.血清封闭:为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前先用血清(与二抗来源一致)封闭,减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的,一般10-30min。
  
  4.一抗孵育条件:在免疫组化反应中重要,包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种:4度、室温、37度,其中4度效果佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般37度1-2h,而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。
  
  5.二抗孵育条件:二抗一般室温或37度30min-1h,具体时间需要摸索,而浓度一般有工作液,若是浓缩液还要摸索浓度,切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间。后,荧光素标记的二抗随着保存时间的延长,可能后有大量的游离荧光素残留,需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。
  
  6.复染:目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。
  
  7.封片:为了长期保存,我们一般用缓冲甘油等封片,此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡,方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液,然后一手拿住盖片某一拐角,而另一手拿对面的那个拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接触到液体时为止;当发现液体接触面在不断弥散时,则可以缓慢降低另一拐角,这样一般不会产生气泡。
  
   8.切片清洗:为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色,所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要,我一般在一抗孵育前的清洗是3min×3次,而一抗孵育后的清洗均为5次×5min。
  
   
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