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免疫沉淀是用于抗原检测和纯化的广泛使用的方法之一
更新时间:2020-08-11 点击次数:990次
 
  
  免疫沉淀是利用抗原抗体特异性反应,从特定混合物(通常是细胞裂解液或表达上清)中纯化富集目的蛋白的一种方法。传统的IP实验是抗体与目的蛋白结合后,再与蛋白ProteinA/G(结合抗体Fc片段)偶联的琼脂糖或磁珠孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G-抗体-目的蛋白复合物,复合物经过洗涤、洗脱后用于后续下游实验。IP是许多蛋白质相关研究的重要步骤,用于研究蛋白质的存在、相对丰度、蛋白表达的上下调、蛋白至稳定性及相互作用等。
  
  免疫沉淀的原理为:针对特定靶蛋白的抗体与样品(细胞裂解物等)中的靶蛋白形成免疫复合物,随后利用ProteinA-磁珠或ProteinG-磁珠将该免疫复合物从混合物中沉淀下来。后将靶蛋白从磁珠上洗脱(如果抗体没有共价连接到磁珠上或使用变性缓冲液进行洗脱,抗体也会被洗脱下来),并通过SDS-PAGE,WesternBlot等手段对洗脱下来的蛋白进行分析。
  
  免疫沉淀固相物质的选择:
  
  对于小型特定蛋白和蛋白复合物的分离,磁珠可实现结合能力、得率、可重复性、纯度和成本节约之间的平衡。当进行手动和自动化标准IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP和pull-down反应并立即用于后续检测分析时,磁珠是理想选择。利用强力磁力架可将磁珠定位到孵育管的侧壁,使其不阻碍细胞裂解物抽吸。磁性分离不需要离心,所以不会导致抗体-抗原结合破坏和目标蛋白损失现象。当需要纯化大量目标蛋白用于下游分析,且特异性抗体较易获得,琼脂糖树脂纯化较为适用。
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