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免疫荧光在操作中每个环节有哪些细节需要注意
更新时间:2022-11-27 点击次数:629次
  免疫荧光是指只标记一种蛋白质分子,方法比较简单,只要按照染色步骤去做,通常不存在太多的问题。但要注意固定液的选择,固定液选择的合适与否,可能会直接影响染色结果。
 
  1、冰冻切片制备:建议用新鲜组织,否则组织细胞内部结构破坏,易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等,防止裂片和脱片严重。
 
  2、组织切片固定:切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10 min,尤其要较长时间保存的白片,一定要及时固定和适当保存。
 
  3、血清封闭:为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前先用血清(与二抗来源一致)封闭,减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的,一般10-30 min。
 
  4、一抗孵育条件:在免疫组化反应中重要,包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种:4℃、室温、37℃,其中4℃效果较佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般37℃1-2 h,而4℃过宿和从冰箱拿出后37℃复温45 min。具体条件还要摸索。
 
  5、二抗孵育条件:二抗一般室温或37℃立即观察,若将标本放在聚乙/烯塑料袋中4℃30 min-1h,具体时间需要摸索,而浓度一般有工作液,若是浓缩液还要摸索浓度,切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后,荧光素标记的二抗随着保存时间的延长,可能后有大量的游离荧光素残留,需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。
 
  6、复染:目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。
 
  7、封片:为了长期保存,我们一般用缓冲甘油等封片,此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡,方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液,然后一手拿住盖片某一拐角,而另一手拿对面的那个拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接触到液体时为止;当发现液体接触面在不断弥散时,则可以缓慢降低另一拐角,这样一般不会产生气泡。
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