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细胞的复苏及冻存方法
更新时间:2015-10-19 点击次数:1216次

  
  一.细胞复苏与培养
  
  将液氮或-80℃保存的肿瘤细胞于37℃水浴,快速溶化,用8.0ml培养基混匀已融化的肿瘤细胞悬液,于1500转/分,离心3分钟。弃上清,再吸取8.0ml培养基质混匀细胞沉淀,再1500转/分,离心3分钟,弃上清,细胞沉淀用1.0ml培养基混匀,备用。另取一个75cm2方瓶,加入14.0ml培养基质,将上述制备的含肿瘤细胞悬液(1.0ml)加入此方瓶中,于37℃,5%CO2孵育箱中培养。
  
  若此肿瘤细胞悬浮生长,大约3-4天细胞基质会变黄,5.0ml细胞悬液可传代一个方瓶培养,可用3-4个方瓶培养,一个方瓶中呈对数生长的肿瘤细胞可达1-1.5×107个,根据试验所需,可决定传代的次数。若此肿瘤细胞呈贴壁生长,经过3-4天,肿瘤细胞生长至80%-95%单层时,弃上清,用0.5mM的EDTA(难消化的肿瘤细胞用0.25%胰酶1.0ml),处理肿瘤细胞大约3-5分钟,用倒置显微镜观察,当90%的肿瘤细胞变圆时,即可用弯管吹打并将消化的细胞转移到15ml离心管中,于1500转/分下,离心3分钟,弃上清,加少许培养基混匀,可传代3个75cm2方瓶扩大培养。
  
  二.细胞冻存
  
  将对数生长的肿瘤细胞用1个75cm2方瓶按上述方法收集,于1500转/分离心3分钟,弃上清,用保种液(含10%DMSO的小牛血清)3.0ml混匀,分别加入到2-3只保种管中,写上肿瘤细胞名称、时间、保种者姓名,放-80℃保存,次日将它们转移到液氮中保存(注:-80℃下可保存细胞半年至一年,液氮可保存细胞5-10年,甚至更长的时间)。以上所有物品均需经过高温灭菌(121℃,30分钟),培养基质则经过过滤(0.22uM)除菌,所有操作均必须遵守无菌操作技术,避免细菌、真菌、病原体、衣原体等污染。
  
  
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